5.1 Сущность и классификация ИФА.

ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для индификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. В разработке метода принимали участие Е.Энгвалл и Р.Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р.Шурс.

Рис. 6 Основной принцип ИФА:

для выявления антигенов; 2) для выявления антител

Метод основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом, в результатереакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывается окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически (рис. 6).

Открытие возможности иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением их связывающей активности позволило расширить использование ИФА в различных областях биологии и медицины.

Появление моноклональных антител послужило дальнейшему развитию ИФА, что позволило повысить его чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов.

Теоретически ИФА основывается на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на главных принципах аналитической химии. Чувствительность ИФА и время его проведения определяется несколькими основными факторами: кинетическими, термодинамическими характеристиками реакции антиген-антитело, соотношением реагентов, активностью фермента и разрешающей способностью методов его детекции. В общем виде реакция антиген-антитело может быть описана простой схемой:

+[АГ]↔[АТАГ]

Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода.

Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:

1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса;

2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;

3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал. В основу классификации методов ИФА положено несколько подходов:

1. По типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА, различают конкурентный и неконкурентный методы.

А) В конкурентном ИФА на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментном и конкурирующий за центры специфического связывания с ним.

Б) Для неконкурентных методов характерно присутствие в системе на первой стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания.

2. Все методы ИФА делются на гомогенные и гетерогенные.

Если все три стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов, метод относится к группе гомогенных.

В основе гомогенного ИФА, применяемого, как правило, для определения низкомолекулярных субстанций, лежит ингибирования активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. Активность фермента восстанавливается в результате реакции антиген-антитело.

При связывании антитела с антигеном, содержащим ферментную метку, происходит ингибирование активности фермента на 95% по отношению к высокомолекулярному субстрату, что обусловлено стерическим исключением субстрата из активного центра фермента. По мере увеличения концентрации антигена связывается все больше антител и сохраняется все больше свободных конъюгатов антиген-фермент, способных гидролизовать высокомолекулярный субстрат. Анализ проводят очень быстро, для одного определения требуется 1 минута. Чувствительность метода достаточно высока. С его помощью можно определить вещество на уровне пикомолей.

Для гетерогенных методом характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы – носителя, и обязательная стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывка), которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а непрореагировавшие комплексы – в растворе). Гетерогенные методы, в которых формирование иммунных комплексов на первой стадии протекает на твердой фазе, называют твердофазными методами.

Методы относятся к гомогенно- гетерогенным, если 1 стадия – образование специфических комплексов происходит в растворе, а затем для разделения компонентов используют твердую фазу с иммобилизированным реагентом.

3. По принципу определения тестируемого вещества:

А) Прямое определение концентрации вещества (антигена или антитела) по числу провзаимодействующих с ним центров связывания. В этом случае ферментная метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе АГ-АТ. Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу.

Б) Определение концентрации вещества по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижаться, следовательно, в данном случае прослеживается обратная зависимость от величины регистрируемого сигнала.

5.2 Характеристика компонентов, используемых в ИФА.

Ферменты.

Ферментные метки обладают чрезвычайно мощьным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. Таким образом, фермент, присутствующий в ничтожных количествах, можно выявить и количественно определить по образованию продуктов, катализируемой им реакции. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в молекуле многочисленных функциональных групп (сульфгидрильных, карбоксильных, остатков тиразина и др.), через которые можно ковалентно присоединить молекулы лиганда.

Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами:

– высокая активность и стабильность фермента в условиях анализа, при модификации и в конъюгате с антителами или другими белками;

– наличие чувствительных субстратов и простота метода определения продуктов или субстратов ферментативной реакции;

– возможность адаптации субстратных систем к дальнейшему усилению;

– отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемой биологической жидкости.

В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза. Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью.

Субстраты.

Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична.

Основные требования к субстрату:

– обеспечение высокой чувствительности метода при выявлении фермента в конъюгате;

– образование хорошо учитываемых (например, окрашенных) продуктов реакции фермент-субстрат;

– субстрат должен быть безопасным, дешевым, доступным и удобным для применения.

Чаще используют хромогенные субстраты, которые, разрушаясь, образуют окрашенное вещество. Перспективным является использование высокоэнергетических субстратов – флуоресцентных, хемипюминесцентных. Применение таких субстратов позволяет теоретически повысить чувствительность ИФА на два порядка.

Образование конъюгата.

Конъюгат – это антиген или антитело, меченные ферментной меткой. Образование коньюгата – один из важных этапов проведения ИФА.

При формировании конъюгата подбирают такой оптимальный метод введения ферментной метки, чтобы оба компонента конъюгата сохраняли свою биологическую активность: фермент - способность взаимодействовать с субстратом, а антиген или антитело - антигенность и антигенсвязывающую активность, соответственно. Наличие меченого, высокоочищенного антигена позволяет использовать конкурентные методы. В этом случае на конечном этапе можно измерять активность конъюгата, не связанного с иммобилизованными антителами, что позволяет избежать процедуры отмывки и делает анализ более удобным. Однако антигены разнообразны по своим физико-химическим свойствам и строению, а значит невозможно разработать универсальные методики для получения конъюгата с антигеном. В этом случае получение конъюгата антигена с ферментом представляет собой отдельную сложную задачу. Приготовление меченых антител для ИФА методически более доступно.

Конъюгирование фермента с иммунохимически активными белками производится различными методами: химическая сшивка, ковалентное связывание молекулы фермента с АГ или AT и образование соединений через нековалентные связи, например, когда связь между ферментом и АГ или AT осуществляется иммунологически, через взаимодействие антиген-антитело.

Наиболее широкое распространение получили ковалентные способы приготовления конъюгатов. Выбор реакции связывания определяется типом доступных функциональных групп в данных белковых молекулах. В качестве реагентов, используемых для введения фермента в молекулы антигенов и антител, используют глутаровый альдегид, периодат натрия и др.

Существует одноэтапный и двухэтапный методы получения конъюгатов с помощью глутарового альдегида. Могут образовываться конъюгаты различных размеров с редуцированной ферментативной активностью (15 - 60 % от свободного фермента). Образовавшийся конъюгат больших размеров может стерически затруднять определение тестируемого вещества. Конъюгаты с относительно низкой молекулярной массой состоят из Fab-фрагмента и одной молекулы фермента.

В результате двухэтапного синтеза, который заключается в поэтапном получении сначала модифицированного с помощью сшивающего агента фермента, его выделении, а затем последующем взаимодействии его с антигеном (антителом), образуются молекулы однородного состава, содержащие 1-2 молекулы фермента на молекулу иммуноглобулина и сохраняющие высокую ферментативную и иммунологическую активность. Однако количество таких образовавшихся конъюгатов невелико (для пероксидазы хрена составляет 5 - 10 %).

Наибольшее практическое применение нашел метод получения иммунопероксидазных конъюгатов, основанный на окислении углеводного компонента фермента периодатом натрия (связывание пероксидазы в конъюгат достигает 70-90 % от начального количества фермента).

Надежный конъюгат должен обладать следующими свойствами:

Высоким антительным тигром и высокой афинностью к антигену, чтобы его можно было использовать в большом разведении, и таким образом, уменьшить неспецифическое связывание;

Достаточной специфичностью в рабочем разведении;

Преобладанием мономерных форм над полимерными, т.к. полимерные формы имеют тенденцию к неспецифической адгезии на пластике, что приводит к высокому фоновому уровню реакции;

Оптимальным молярным соотношением между ферментом и антителами (оптимальное соотношение составляет около 1:1);

Достаточной ферментативной активностью конъюгата. Это свойство определяется главным образом условиями конъюгации и соотношением молекул фермента и антител в конъюгате.

5.3 Гетерогенные методы ИФА.

Гетерогенные ИФА (или твердофазные ИФА) включают методы, в которых анализируемое соединение находится в двух фазах. Для разделения компонентов иммунохимической реакции используют твердую фазу (нерастворимый носитель, как правило, пластик) с иммобилизованными на ней антителами или антигеном, которую отмывают на каждой стадии с целью удаления промежуточных продукто непрореагировавших компонентов.

Иммобилизацию можно проводить путем ковалентного связывания антител (антигенов) с активированным носителем, используя химические подходы, а также путем физической адсорбции антител (антигенов) на поверхности твердых полимеров (например, полистирольных пластин). В зарубежной литературе это направление получило название ELISA-тест или энзимсвязанный иммуносорбентный метод (от англ. enzyme-linked immunosorbent assay).

Неконкурентный ИФА определения антигенов на примере использования меченых ферментом специфических антител и иммобилизованных антител.

К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации образуется специфический комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся антигенов и добавляют меченые антитела – конъюгат. При этом количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству антигена в исследуемом образце. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата добавляют хромогенный субстрат для используемого фермента, который изменяет цвет под действием фермента, т. е. происходит ферментативная реакция с окрашиванием раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству меченых ферментом специфических антител, фермента и, соответственно, исследуемого антигена. Измерения оптической плотности раствора в лунках при определенной волне (в зависимости от используемого субстрата) проводят с помощью специальных спектрофотометров, адаптированных для микропланшетов – ридеров. Количественную оценку концентрации антигена в пробе определяют, сравнивая результаты с калибровочной кривой зависимости оптической плотности раствора от концентрации стандартного раствора антигена.

Рисунок 7.

Поскольку на стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается связанным с молекулами иммобилизованных и меченых антител, в литературе этот метод часто называют «сэндвич»-метод (от англ. sandvich) или двухцентровый метод ИФА (от англ. two-site assay).

Этот метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых имеется, по крайней мере, две антигенные детерминанты. Для анализа большого количества моновалентных антигенов (лекарственных соединений, пестицидов и др.) он неприемлем.

Основное достоинство данного метода – высокая чувствительность. Предел обнаружения соединений данным методом в настоящее время достигает величины порядка 10-21 моль, что соответствует обнаружению в образце всего 600 молекул анализируемого вещества. Максимальная чувствительность достигается при проведении каждой иммунологической реакции в равновесном режиме, что сказывается на длительности проведения анализа, которая в среднем составляет 4 – 6 часов. Неконкурентный ИФА определения антител на примере использования меченых ферментом вторичных антител и иммобилизованных антигенов.

К иммобилизованному антигену добавляют исследуемую сыворотку. После инкубации и отмывания от несвязавшихся антител добавляют меченые вторичные антитела, которые специфичны к анализируемым антителам. После вторичной инкубации и удаления избытка меченых вторичных антител содержание ферментной метки на носителе пропорционально концентрации специфических антител в сыворотки.

Данная схема является одной из наиболее распространенных ИФА определения антител, поскольку позволяет выявлять антитела к разным антигенам.

Гетерогенный конкурентный ИФА определения антигена на примере использования меченого антигена и иммобилизованных антител.

К иммобилизованным на носителе антителам добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген и фиксированную концентрацию конъюгата антигена с ферментом. После проведения инкубации носитель отмывают от несвязавшихся свободного и меченого антигена и регистрируют ферментативную активность на носителе, которая обратно пропорциональна концентрации определяемого антигена.



5.4 Гомогенный метод ИФА.

Гомогенный иммуноферментный анализ (ГИФА) - наиболее простой в методическом отношении вид ИФА. При его постановке один из участников иммунной реакции (обычно это низкомолекулярный антиген) метится ферментом и за ходом формирования комплекса антиген-антитело следят, регистрируя изменение активности фермента.

Такое нарушение ферментативной активности может возникать либо за счет пространственного разобщения фермента и субстрата, либо за счет конформационных изменений в молекуле фермента, сопровождающих формирование иммунного комплекса. ГИФА имеет ряд существенных преимуществ перед другими иммунохимическими методами. Во-первых, высокая экспрессия (весь анализ с помощью ГИФА, занимает минуты и даже доли минут).

Рис. 8 Варианты гомогенного иммуноферментного анализа (А- эффект разобщения фермента (Ф) и субстрата (С) за счет стерических препятствий при взаимодействии антигена (Аг) и антитела (Ат); Б- эффект изменения конформации фермента при формировании комплекса антиген- антитело).

Во-вторых, метод имеет одну стадию и не требует трудоемких и требующих времени этапов промывки. И наконец, в-третьих, метод требует минимальных объемов (8-50 мкл) и количеств биологического или клинического образца. Однако у метода ГИФА имеется один крайне существенный недостаток - на его основе можно создавать диагностические тест-системы только для низкомолекулярных антигенов. Только, в этом случае антитело, взаимодействуя с антигеном, может эффективно экранировать или модифицировать связанную с этим антигеном молекулу фермента. Именно в связи с этим, (несмотря на кажущуюся простоту и очевидные преимущества перед другими методами, на основе ГИФА были созданы диагностикумы для выявления только гормонов, пептидов, лекарственных и наркотических веществ и некоторых низкомолекулярных белков.

5.5 «Сэндвич» - вариант ИФА для выявления антигенов.

Антигены, определяемые с помощью данного варианта ИФА, должны иметь несколько эпитопов, способных связывать антитела, или обладать повторяющимися, пространственно разделенными эпитопами одинаковой специфичности.

При проведении этого варианта ИФА высокоспецифичные поли- или моноклональные антитела, адсорбированные на твердой фазе, инкубируют с исследуемым образцом. После процедуры отмывания в лунки вносят меченные ферментом антитела (конъюгат) к тому же антигену и далее проводят все остальные этапы реакции. Эффективность образования специфического комплекса на каждой стадии анализа зависит от константы связывания реакции антиген-антитело.

В современной лабораторной диагностике инфекционных болезней широкое применения нашел метод иммуноферментного исследования крови (ИФА), основанный на обнаружении специфических, характерных для возбудителей антител.

В чем суть метода?

Чтобы это понять, следует знать, как работает иммунная система человека, что такое антиген, антитела, какие функции они выполняют.

Антиген в нашем организме представляет собой молекулу, которая специфично связывается с антителом. Он переносит определенную информацию о клетке.
Когда в кровь попадает чужеродный антиген, начинают вырабатываться антитела (иммуноглобулины Ig), которые распознают его и стремятся уничтожить.
Такое взаимодействие называется иммунным комплексом, на котором и основан метод диагностики ИФА.
Анализ позволяет определить уровень гормонов, иммуноглобулинов, иммунологических комплексов и других биологически активных веществ, поэтому важен для комплексной диагностики .

Кому показана диагностика?

Специалист может назначить исследование с целью:

По сравнению с другими методами исследования ИФА обладает целым рядом преимуществ:

Задайте свой вопрос врачу клинической лабораторной диагностики

Анна Поняева. Закончила нижегородскую медицинскую академию (2007-2014) и Ординатуру по клинико-лабораторной диагностике (2014-2016).

Из недостатков можно отметить возможную неточность расшифровки . Иногда анализ показывает ложноотрицательный или ложноположительный результат, особенно при неправильной подготовке или нарушении техники выполнения.

Как выполняется?

Процедура ничем не отличается от взятия материала для .

После назначения анализа пациент направляется в лабораторию для забора венозной крови. Процедура проводятся утром на голодный желудок.
Материал отправляется в лабораторию, где из крови получают сыворотку, в которой находятся антитела.
Сыворотку помещают в пробирки с наборами антигенов. В практике таких наборов применяется много. Это могут быть разные аллергены (пыльца, шерсть, цитрусовые, молоко и другие), возбудители инфекционных и вирусных заболеваний и другие.
После получения реакции остатки сыворотки сливают. Количество антител определяют при помощи специальных индикаторов.

Сроки изготовления анализа

Срок выполнения зависит от конкретной лаборатории. Некоторые лаборатории предоставляют результаты в течении 1-2 дней , другие в течение 1 недели. Задержки могут быть из-за накопления определенного количества сывороток.

Подготовка к исследованию

Перед сдачей анализа следует придерживаться простых правил подготовки:

Исключить прием любых медикаментозных средств накануне анализа. Если это невозможно, обязательно поставьте в известность врача, назначающего диагностику. Особое внимание уделяется лекарствам от аллергии. Если пациент принимает антигистаминные препараты, следует проконсультироваться с врачом, за сколько до начала исследование нужно их отменить. Это касается и некоторых лекарств для щитовидной железы. Иначе концентрация ТТГ может быть определена неправильно и результат нормы и патологии будет получен неверно. Как правило, в норме антибактериальные, противовирусные, антигистаминные препараты прекращают принимать за 10-16 дней до диагностики .
Кровь забирается строго натощак . Последний прием пищи в норме должен быть за 8-12 часов до поездки в лабораторию.
Нельзя принимать алкогольные напитки и курить, иначе это повлияет на норму результатов.
Следует исключить любые стрессовые факторы, физические нагрузки. Обязательно хорошо выспаться.

Все, что вам необходимо знать про анализ на примере одной из лабораторий

Что может повлиять на результаты?

Анализ ИФА — достаточно точный метод исследования. Погрешности возникают в случаях:

нарушении процедуры взятия материала;
при неправильной транспортировки и хранении материала;
во время приема некоторых медикаментозных средств (препараты для щитовидной железы, например, которые могут повлиять на концентрацию ТТГ);
при наличии скрытых заболеваний (в том числе ЗППП, хламидии, например), нарушениях обмена веществ, иммунодефиците;
в период новорожденности, когда в норме в организме присутствуют еще материнские антитела.

Расшифровка, значения (нормы и патологии)

Когда анализ будет готов, пациент получает бланк, где указываются отрицательные (-) и положительные (+) результаты определения каждого класса иммуноглобулинов. Интерпретация может быть такая:

На выздоровление пациента указывают отрицательный результат IgM , без определения IgA, IgG.
Хроническое инфекционное заболевание подразумевает расшифровка: (-) IgM и отрицательный, положительный IgG, IgA.
Об отсутствии защитной реакции к инфекциям указывают (-) значения IgM, IgG, IgA.
Острая инфекция обнаруживается при отрицательном или положительном IgG и IgA, (+) IgM.
Постинфекционный иммунитет при (-) IgM, IgA и положительном значении IgG.
Обострение хронического заболевания — (+) показателях IgM, IgG, IgA.

Наглядная демонстрация ИФА анализа

Где сделать?

Анализ крови методом ифа считается востребованной диагностикой и предлагается различными лабораториями, клиниками города.

В Москве анализ ИФА можно сделать:

в лаборатории Ниармедик,
Инвитро,
Царской клинике,
Дельтаклинике,
ЛДЦ Кутузовском,
МедЦентрСервисе,
сети Онклиник,
Чудо докторе,
Семейном докторе,
К+31,
ООО Медицине и других.

В Санкт-Петербурге анализ ИФА проводится

в Мэдисе,
Американской медицинской клинике,
Клинике доктора Филатова,
Medem,
Клинике Доктора Пеля,
Лека-Фарм,
Инклиник,
Экспрессе и других.

Очень полезный учебный фильм про анализ ИФА

Стоимость исследования

Складывается от количества нужных маркеров. Чем больше маркеров, тем выше цена.

Цена на определение антител к

цитомегаловирусу Igm/IgG варьируется в пределах 350-700 рублей,
к микоплазме 340-520 рублей,
к кандиде 320-450 рублей,
Анти-Хламидия tr. IgA + Анти-Хламидия tr. IgG 1000-1300,
антитела класса IgM к Хламидии 500-600 рублей и т.д.
Забор крови в среднем составляет 150-250 рублей.

Некоторые клиники и лаборатории предоставляют услугу отправки результатов по электронной почте. Услуга бесплатна.

Диагностика ИФА занимает особое место в диагностике заболеваний.

Она характеризуется широким спектром действия , быстротой и удобством проведения, высокой точностью результатов, приемлемой стоимостью. Она востребована, поэтому доступна в разных клиниках и лабораториях города.

(ИФА) - это способ исследования крови в лаборатории, основанный на поиске специальных клеток - антител к различным заболеваниям. Метод позволяет не только выявить возбудителя, но и установить, на какой стадии находится патологический процесс. Последнее очень важно для прогноза и дальнейшего лечения пациента.

Преимущества и недостатки метода

Среди всех современных методов диагностики ИФА является самым инновационным и технически точным. Его основными преимуществами являются:

Способность поиска всех существующих антител к инфекционным заболеваниям в крови пациента.
Высокая доступность метода исследования. На сегодняшний день анализы методом ИФА может выполнить любая лаборатория среднего масштаба.
Практически 100% специфичность и чувствительность метода.
Возможность поиска антител и антигенов, а также установление стадии патологического процесса и отслеживание его динамики, благодаря сравнению количества.

Такое количество преимуществ перед другими анализами полностью затмевает один-единственный недостаток анализа: он способен выявлять антитела, но не самого возбудителя.

Основные термины для оценки анализа

Для того чтобы разобраться в том, какой бывает ИФА-анализ, что это такое и как выполняется, нужно познакомиться с основными терминами, применяемыми специалистами.

Антитело - белок, который вырабатывается клетками иммунной системы человека (лимфоциты типа В). Они отвечают специфической реакцией на попадание в организм чужеродного агента или вещества. Другое название антител - иммуноглобулины, они принадлежат к разным классам: A, E, M, G. Они отличаются друг от друга массой, скоростью реагирования, периодом полураспада и рядом других характеристик. В норме кровь человека содержит в основном иммуноглобулины класса G. Если происходит какое-либо инфицирование, то резко увеличивается количество иммуноглобулинов A и M. Иммуноглобулины E принимают участие в аллергических реакциях.
Антиген - чужеродный агент, имеющий органическое происхождение и высокую молекулярную массу. Чаще всего представляет собой возбудителей или их биологически активные вещества.
Комплекс "антиген-антитело", или иммунный комплекс, - это непосредственно комбинация чужеродного вещества и иммуноглобулина, дающая развитие иммунной реакции.

Суть и область применения метода

У пациентов зачастую возникает вопрос: ИФА-анализ, что это такое, как выполняется и для чего он нужен? Доступно о методе можно рассказать, описав вкратце его стадии.

Подготовительная стадия . Врач лаборатории использует специальный планшет, в котором 96 лунок. На поверхность каждой лунки нанесен антиген определенного возбудителя.

Стадия 1. Выполняется забор крови, которая затем по капле наносится на лунку. В лунке запускается реакция между антигеном и антителом в крови.

Стадия 2. В лунке полным ходом идет реакция с образованием иммунных комплексов. В результате образуется вещество определенного цвета. Интенсивность окраски зависит от количества антител в крови пациента к каждому конкретному возбудителю.

Стадия 3. Оценка результата путем фотометрии. Для этого применяется специальный прибор под названием "спектрофотометр". С его помощью сравнивается плотность материала в лунке и контрольного образца. Далее прибор путем математического анализа генерирует результат.

Оценка результатов и предназначение ИФА

Интерпретация результата зависит от нескольких важных нюансов:

Оптической плотности лунки.
Производителя пластины с лунками (тест-системы).
Лаборатории, в которой выполнялось исследование.

Учитывая эти нюансы, никогда не следует сравнивать два результата с разных тест-систем или из разных лабораторий.

Еще одним немаловажным моментом, влияющим на анализ ИФА, является так называемая авидность антител. Этот параметр характеризует количество антигена, прочность связи в комплексе "антиген-антитело". В основе его определения лежит обработка иммуннокомплекса мочевиной с целью разрешения белковых структур. Это позволяет разрушить слабые связи между антигеном и антителом и оставить только прочные. Значение исследования на авидность заключается в том, что с его помощью можно узнать срок инфицирования. Эта информация чрезвычайно важна для постановки диагноза беременным женщинам.

Анализ крови методом ИФА служит:

Для поиска различных антигенов возбудителей.
Для исследования гормонального фона.
Для обследования на наличие аутоиммунной патологии.
Для обнаружения маркеров онкологических заболеваний.

Разновидности ИФА

Анализ ИФА имеет следующие разновидности:

Непрямой.
Прямой.
Конкурентный.
Метод блокирования.

Но на деле сегодня применяется только способ под названием ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). В его основе лежит вышеописанная реакция образования комплекса антигена с антителом с изменением окраски на поверхности лунки.

Отдельного внимания заслуживает непосредственно количественный ИФА-анализ крови. Это не разновидность анализа, а способ оценки результатов. Благодаря ему подсчитывается количество антител и определяются их классы. Результат зависит от оптической плотности пробы, тест-системы, на которой выполнялся анализ ИФА, а также от лаборатории.

Заболевания, выявляемые ИФА

ИФА - анализ крови, позволяющий выявить огромное количество различных инфекционных заболеваний. Притом с одинаковой точностью выявляются как вирусные, так и бактериальные заболевания. Например, с помощью образования иммуннокомплексов можно доказать наличие антигенов возбудителей следующих заболеваний:

Кроме того, ИФА позволяет обнаружить:

Маркеры онкологических заболеваний - ФНО (фактор некроза опухоли), ПСА (простатспецифический антиген), РЭА (раково-эмбриональный антиген), СА-125 (маркер опухолей яичников)
Гормон беременности — ХГЧ (хорионический гонадотропин).
Нарушения репродуктивной системы: гормоны женской и мужской половой систем.
Патологию щитовидной железы.

Важно упомянуть, что анализ ИФА на ВИЧ сегодня является главным способом диагностики этого опасного заболевания.

Материал для ИФА и техника забора

Для выполнения ИФА у пациента производится забор крови натощак. Далее из крови получают сыворотку, которая непосредственно используется для проведения анализа. Кроме того, ИФА можно проводить на спинномозговой жидкости (ликворе), слизи цервикального канала (шейки матки), околоплодных водах и даже жидкости стекловидного тела (глазного яблока).

Перед сдачей крови пациента предупреждают о том, что он не должен принимать никаких лекарственных препаратов, а лечение антибиотиками и противовирусными препаратами рекомендуется заканчивать не менее чем за две недели до забора крови.

Сроки получения и расшифровка результатов

Сроки получения ответа из лаборатории зависит не от скорости ее работы, а от того, на какой стадии находится заболевание и какие антитела уже появились в крови. Так, к примеру: иммуноглобулины М появляются примерно через 2 недели после взятия крови на анализ и означают, что процесс находится на стадии первичного инфицирования или произошло обострение хронического. Одновременно антитела классов M и G появляются при первичной инфекции. Притом последние могут обнаруживаться спустя 4 недели.

IgA появляются спустя 2-3 недели либо в одиночку, либо вместе с М, означая острую инфекцию, или вместе с G, указывая на хронический процесс.

Такие разные сроки появления антител в крови заставят пациента долго ожидать результата. Допустимо ожидание более месяца после того, как выполнен анализ ИФА. Расшифровка и интерпретация врачом также занимают определенный промежуток времени.

С прогрессом современной медицины удается проводить более углубленную диагностику при подозрении на те или иные патологии у пациента. Одним из информативных методов лабораторного исследования стал ИФА анализ, который проводят методом забора венозной крови. То есть для пациента ничего в целом не меняется. А вот лаборант-анализатор ИФА проводит сложную технику исследования забранного биоматериала. В том, что такое анализы ИФА и, каковы тонкости применения ИФА метода в качестве диагностического, разбираемся в материале ниже.

Что такое иммуноферментный анализ?

Выработку антител провоцируют сами же антигены, проникшие в организм человека. При вступлении в «битву» за здоровье организма антитела как бы помечают собой антигены, что при исследовании крови и видит лаборант. То есть в забранном биоматериале можно отследить не только наличие инфекции, но и ее следы уже после того, как организм полностью выздоровел.

Таким образом, назначая иммуноферментный анализ крови пациенту, лечащий врач может отследить давность инфекции, степень ее прогрессирования или выявить наличие иммунитета к той или иной инфекции.

Процесс ИФА диагностики выглядит таким образом:

Забранная венозная кровь приводится в лаборатории в состояние сыворотки крови;
Затем лаборант использует специальный лоток с ячейками, в каждой из которых уже имеются все необходимые антигены. Достаточно просто капнуть в каждую ячейку сыворотку крови и отследить реакцию иммуноглобулинов (антител) на антигены. О наличии «нужной» реакции свидетельствует изменение цвета исследуемого материала. В дальнейшем лаборант изучает оптическую плотность исследуемой среды.

Аскаридоз и энтеробиоз (аскариды и острицы);
Трихинеллез;
Описторхоз в острой и хронической формах;
Лямблиоз;
Амебиоз;
Токсоплазмоз;
Лейшманиоз в любой форме.

Важно: иммуноферментный анализ бывает как качественным, так и количественным. В первом случае лаборант лишь подтверждает или опровергает наличие искомого вещества в крови. Во втором случае в результате анализа указывают его концентрацию в организме пациента.

Недостатки метода

При всех достоинствах такого способа диагностики стоит понимать, что иммуноферментный анализ крови - не способ нахождения причины болезни пациента, а лишь метод подтверждения предполагаемого лечащим врачом диагноза. А ввиду того, что исследование является достаточно недешевым, использовать его нужно с умом. При этом результаты исследования должен трактовать только квалифицированный специалист.

Расшифровка результатов

После того как мы разобрали аббревиатуру ИФА и что это такое ─ выяснили, стоит перейти к трактовке результатов. Здесь важно понимать, что если анализ проводили качественный, то результат будет лишь положительным или отрицательным. То есть диагностика либо подтверждает подозрения доктора относительно определенного диагноза, либо опровергает их. В этом случае в бланке будут стоять символы «+» или «-» соответственно.

Важно: отрицательный результат анализа не всегда свидетельствует об отсутствии инфекции. Дело в том, что антитела к антигенам могут формироваться в течение 14 дней после инфицирования и вполне вероятно, что они еще не сформированы.

В случае же если проводится количественный анализ, то здесь определяется вид антител, их количество и стадия активности. В частности при такой диагностике определяют антитела (иммуноглобулины) IgG и IgM, которые формируются в разные периоды прогрессирования инфекции. Самыми распространенными вариантами результатов в этом случае являются:

Повышенный IgМ и полное отсутствие IgG. Такая картина свидетельствует о недавнем инфицировании и острой фазе течения патологии.
Повышенная активность иммуноглобулинов обоих видов (IgМ и IgG). Говорит о давнем и хроническом протекании инфекционного процесса.
Активность IgG и полное отсутствие IgМ. Инфицирование было не менее полугода назад и сейчас вирус пребывает в затяжной хронической стадии.
Отсутствие антител IgG и IgA. Результат не определен.
Отсутствие антител IgM, IgA и IgG. Свидетельствует об отсутствии иммунитета к определенной инфекции.
Активность антител IgG, IgM и IgA говорит об обострении хронического процесса.

Помимо выявления типов антител лаборант в специальной графе бланка указывает и их количество на объем крови. Помните, разобравшись в том, что такое метод ИФА, не трактуйте результаты самостоятельно. Полученные результаты с точностью может интерпретировать только лечащий врач в зависимости от предполагаемого диагноза, выстраиваемого на основании клинической картины у пациента.

Трезвость